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重組透明質酸脢之表現生產及其應用

為了解決honda hornet的問題，作者范秀 這樣論述：

透明質酸脢是水解透明質之酵素，廣泛分佈於自然界，存在於哺乳類動物、昆蟲、水蛭及細菌中，本論文首先在第一、二章對透明質酸脢的分類、來源、活性分析法、生物化學特性、觸媒反應機制、及其在醫藥、生物產業上之應用做了詳盡、廣泛的文獻回顧。第三章中以基因工程的方法將細菌Streptococcus pyrogenes之噬菌體H4489A所含之透明質酸裂解脢(hyaluronate lyase)基因在大腸桿菌中表現，透明質酸裂解脢是屬於透明質酸脢之一種，裂解透明質酸產生出具不飽和鍵之多醣，重組透明質酸裂解脢經固定金屬層析後，再以離子交換層析純化，所得之純化酵素分子量約40 KDa，最佳反應pH、溫度分別在5

.5及37oC。在第四章中探討多種二價金屬離子及界面活性劑對此重組透明質酸裂解脢活性之影響，鎂離子可活化但銅、鎳、鈷離子完全抑制其活性。其反應動力學可以Michaels-Menten模式來描述，其中動力學參數Km為0.44mg/ml，最大反應速率Vm為0.20 贡mol/ml/min，變性溫度在46 oC左右。此外也以CD光譜在尿素及鹽酸胍 (guanidine hydrochloride) 等變性劑的作用下研究透明質酸裂解脢之二級結構。在第五章中討論裂解脢裂解透明質酸所產生出具不飽和鍵之多醣，經陰離子交換層析分離後可得到20種片段不同之不飽和多醣，此不飽和多醣對四種腫瘤細胞具有輕微之細胞毒性

，但有抗脂質(lipid)氧化的能力，及清除自由基的活性。第六章中將探討人類精子細胞膜表面之透明質酸水解脢(rhuPH20) 的異源表現，以嗜甲基酵母菌(Pichia pastoris)為宿主細胞，所使用之調控系統為組成性之GAP表現系統，經抗His-tag及PH20之抗體檢驗，證實rhuPH20可成功地被嗜甲基酵母菌所表現出來，培養基之碳源對其表現量有很大的影響，其中以甘油為碳源可得最佳之表現量，經Zymography分析胞外表現之rhuPH20證實其具有活性，在native及reducing條件所測得其分子量分別為120 KDa及56 KDa，推論嗜甲基酵母菌所表現之rhuPH20以dim

er型式存在。